MUESTRAS
A. PRINCIPIOS GENERALES PARA UNA MUESTRA: Debe ser tomada en el sitio de la lesión, enviada rápidamente al laboratorio, recogida y trasportada con técnica adecuada y correctamente etiquetado.
B. DATOS SOBRE MUESTRAS
SANGRE: Rendimiento óptimo para hemocultivo cuando se obtienen al menos 2-3 muestras de 10-30 ml, con intervalos de 30 minutos a h., obtenidas en el ascenso de los picos febriles y antes de un tratamiento antimicrobiano. El hecho de que en tres hemocultivos se aísle el mismo microorganismo avala el argumento de que se trata de un verdadero positivo y por ello cabe excluir la contaminación.
- ORINA: Es importante (sobre todo en mujeres) la limpieza periuretral previa. Se toma de micción media, (se desechan los primeros 25 ml. de las muestras). Si no se puede obtener de la micción se hace mediante cateterismo o punción suprapúbica, (está preferible si se sospechan anaerobios). Por micción es sugestivo de infección encontrar una muestra única de l05 micr/ml en varones o dos en mujeres si son asintomáticos, pero en caso de síntomas (disuria) un hallazgo algo menor ya es sugestivo. Cualquier crecimiento significativo si muestra suprapúbica.
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR): Se obtienen 2 ml. para medir células, glucosa, proteínas, hacer cultivos... Si hay tinción Gram negativa haríamos contrainmunoelectroforesis, aglutinaciones... Es útil el estudio de la presión y aspecto del LCR.
- ESPUTO: Se considera una buena muestra de esputo la que lleve al menos 10 células epiteliales y más de 25 leucocitos por campo de pequeño aumento (criterios de Murray En general la rentabilidad es muy variable, depende de la calidad de la muestra, experiencia del observador, de sí el paciente tomó previamente antibióticos...
- OTRAS MUESTRAS: Vías respiratorias inferiores (lavado bronquioalveolar, punción), heces para coprocultivos, piel, exudados, tomas vaginales, aspiración de abscesos...
EXAMEN MICROSCÓPICO
B. PREPARACIONES EN FRESCO
- Examen en campo oscuro de lesiones con sospecha de sífilis para buscar el Treponema.
- Examen de raspaduras en KOH: Dermatomicosis.
- Búsqueda de Cryptococcus en LCR.
- Búsqueda de protozoos o quistes en heces o aspirado duodenal ante sospecha de parasitosis.
- Frotis sanguíneos para microtilarias (Filariasis).
C. TINCIONES
- TINCIÓN GRAM: Además de demostrar la presencia de gérmenes, nos permite la primera gran clasificación: Gram+ y Gram-. Se evidencia forma (cocos, bacilos...), agrupación (aislados, racimos, pareias)
- TINCIÓN ZIEHL-NEELSEN: Bacilos ácido-alcohol-resistentes. Se utiliza para Micobacterias, útil: Criptosporidíum, Isospora y Nocardia.
- TINCIÓN WRlGHT: Tinción de frotis de sangre en busca de Borrelias, protozoos (plasmodium)... Una variante, con metenamina argéntica o azul de toluidina, se utiliza para Pneumocystis iiroveci.
- TINCIÓN GIEMSA: Clamidias y Micoplasma. También en frotis de sangre para Borrelias y Plasmodios.
- TINCIÓN AZUL DE METILENO: Demostración de los gránulos metacromáticos de Corynebacterium o la presencia de leucocitos en heces.
- HEMATOXlLlNA FÉRRICA: Protozoos.
- TINCIÓN TRICROMICA: Protozoos.
- REACCIÓN DE FEULGER: Material nuclear.
- MÉTODO DE SCHAEFFER Y FULTON: Endosporas.
- TlNCIÓN NEGATIVA: Se pone una gota de tinta china o nigrosina y se deja secar al aire; al microscopio se ve campo negro y las células no se tiñen. Evidencia cápsula, p.e.: Criptococo, halo sin tinción alrededor.
- TINCIÓN GIMÉNEZ: Rickettsias, Legionella.
- TINCIONES CON FLUOROCROMOS (RODAMINA): Micobacterias, con microscopio de fluorescencia.
E. MICROSCOPIA ELECTRONlCA: Su mayor aplicación resulta en el diagnóstico de viriasis.
F. MICROSCOPIA DE INMUNOFLUORESCENCIA
- Las muestras o cultivos se tiñen con anticuerpos específicos que llevan sustancias fluorescentes.
- Útil para examen de tejido cerebral en caso de rabia o encefalitis herpética. También para diagnóstico de otras viriasis (CMV), Legionella, Clamidia, Pneumocystis... o para la detección de anticuerpos como en la prueba FTA-abs para sífilis.
- LA MICROSCOPIA DE HIBRIDACIÓN es una variante. Los microorganismos en los portas se hibridan con sondas fluorescentes complementarias de ARN ribosómico.
TÉCNICAS GENÉTICAS
A. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Esta técnica está hoy muy extendida, se utiliza para amplificar un fragmento de ADN, (es decir, obtiene un gran número de copias partiendo de una única copia original o molde); su utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar agentes como bacterias y virus. Se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN. Hoy este proceso está automatiza— do en un aparato que se llama termociclador.
La PCR se emplea también en identificación de ADN con fines forenses (identificación cadáveres, test de parternidad...), clonación de ADN.
B. SONDAS DNA O RNA:
Son secuencias de nucleótidos exclusivas de una cepa, especie o género. Se añaden a muestras, cultivos... (marcadas con isótopos o con marcadores enzimáticos). Si la muestra tiene una secuencia complementaria con la de la sonda, se produce hibridación y la muestra queda marcada.
OTRAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS
- RIA: Similar a ELISA, solo que el marcaje no es por un enzima, sino que radiactivo (isótopo).
- Reacción de neutralización o protección: El suero de un paciente que haya sufrido enfermedad por un virus protege a un animal de experimentación de su infección o a un cultivo celular de sus efectos citopáticos. Lo mismo con reacciones toxina-antitoxina.
- Pruebas cutáneas: Tuberculina. Demuestran la existencia de infección previa por traducir hipersensibilidad retardada celular.
- Inoculación: Se puede hacer con distintos gérmenes, pero sobre todo se inoculan virus en animales de experimentación, cultivos celulares o huevos embrionarios. Así se estudia patología producida, serología, se aplican técnicas de identificación, se estudian efectos citopáticos.
- Estudio histopatológico: Citodiagnóstico de Tzanck: herpes mucocutáneo. Diagnóstico micosís profundas.
- Inhibición de la hemaqlutinación: Algunos virus pueden aglutinar hematíes de diferentes especies de animales. Esta propiedad se inhibe por anticuerpos del suero del paciente enfermo.
- Baterías bioquímicas de identificación: Aplicadas sobre muestras o cultivos. P.e. reacción de la catalasa, ureasa... reactivos para fermentaciones, oxidaciones... reacción de Voges- Proskauer para Enterobacterias.
En la siguiente presentación de Slide Share encontrarás información relevante acerca del diagnostico en microbiologia.
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